本篇文章给大家谈谈pcr仪多少钱一台，以及数字PCR(二)— Bio-rad ddPCR对应的知识点，文章可能有点长，但是希望大家可以阅读完，增长自己的知识，最重要的是希望对各位有所帮助，可以解决了您的问题，不要忘了收藏本站喔。
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一、数字PCR(二)— Bio-rad ddPCR
数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变
A：最低微滴上样量是和您的实验的突变比例灵敏度需求相关的，人类cfDNA的具体上样需求，可见下表
A：按照泊松分布原理，小于等于5 copies/droplet（100000copies/20ul）的核酸浓度，都能保证总体内有空余微滴存在，通过统计学换算，都可以保证结果稳定，并非必须要求每个微滴单拷贝。20,000个微滴对应的是100,000个拷贝的核酸。即使总微滴数有损失，一般15,000个微滴对应的检测上限也应该是75,000个拷贝。
理论上讲只要有还有1个阴性微滴，ddPCR基于Possion分布都能计算出样本的含量，但是CV%会非常大。可以接受的动态范围是CV%<5%的样本含量范围。对于任何dPCR平台，最佳样本浓度都是λ=0.16时对应的浓度，这个时候CV%是最小的（~1.5%），对应就是最佳上样量了。不过在实际测试中，样本浓度在平台要求的动态范围之内都是OK的
对于20000个微滴，样本浓度的上限（理论上λ=5.5），对应的阳性微滴比例为99.6%，阴性微滴的比例为0.4%，对应阴性微滴的数量是80个。也就是阴性微滴数超过80个是OK的。其实理论上还可以更少，但是考虑到其他不确定度，这个数比较接近实测结果
答：微滴数量低于9000个，从统计学角度来说，抽样量太少，无法使用泊松分布校正，尤其对于高浓度样本来说，定量误差会比较大，检测上限也会降低。如果存在复孔，由于复孔间所有微滴都是独立反应体系，所以可以合并分析复孔数据，将多孔视作一孔。
对于QX200系统来说，如果反应体积是20微升，那么生成的微滴数在20000个左右。实际检测少于20000个，往往来源于系统的死体积、微滴转移时的损失及其他不确定因素。也就是说，微滴制备后，靶标核酸已经随机分布在20000个微滴中，阳性微滴的百分比已经确立，那么后续分析的微滴数量不到20000个，对定量的结果也是无影响的（浓度适合的样本）。实际上我们也遇到过，相同的样本，不同的批次检测，总微滴的数量从4000-20000不等，但是定量的结果无差别。注意，以上的说法前提是“浓度合适的样本”，如果样本浓度太高和太低时，分析的总微滴数偏少，会增加又一个环节的subsampling error,定量的准确性和精度就会受影响了。所以为什么定义8000个微滴，一方面是基于质控的角度。未达到这么多微滴，肯定是有问题的，建议重做；另一方面，对于浓度超高或超低的样本，8000个微滴带来的误差仍小于样本本身取样误差带来影响。
A：样本中的蛋白、有机溶剂、表面活性剂、高粘度物质，生成微滴时的环境温度，PCR时的等因素会影响微滴数量。血液样本中主要判断为蛋白残留以及提取过程中没有除尽的酒精。
答：引物探针一般都是用水或TE溶解，且在整个20微升反应体系内占比很少，所以对最终反应体系的离子强度或pH影响极低。且ddPCR反应预混合本身就是缓冲液，能维持相对稳定的pH。样本一般也是TE或纯水洗脱，如果提取没有问题的话那对体系也基本没有影响，唯一可能的情况是极高的盐离子浓度提高了微滴渗透压影响了内外相平衡，但一般人血为等渗溶液，不会有这么高的盐浓度，除非提取试剂盒有问题，过柱浓缩时洗不掉样品中过高的离子浓度。相比样本中的蛋白、有机溶剂、表面活性剂、高粘度物质来讲，离子对微滴的影响微乎其微。
A：最终测得有效微滴数量超过10,000个，1维图中微滴高度没有出现阶梯式排布，即可认为微滴稳定。
A：ddPCR实验有效性需要分几个方面区分：
理论灵敏度为1个拷贝核酸。实际灵敏度针对您的不同Assay及不同提取手段是需要具体分析的，重复性在不同Assay的不同的浓度范围内也是不同的。您需要参考文献、自身实验、或FDA医疗器械注册时的验证数据。
对于一台PCR仪器一般很少有用分析灵敏度的说法，因为每一种不同的序列都可以判断为不同的分析物，同一种方法针对不同分析物的LLD、BLD、AS、FS都是不同的，需要精确到不同的应用方向和应用试剂。
A：Bio-Rad不同的ddPCR supermix产生的微滴体积都有差别，这就是为什么要在setup实验时，要在软件中正确选择对应的supermix种类，软件会自动调用对应试剂的微滴体积进行计算。不同试剂的微滴体积，在研发时已经通过测试获得并应用于quantasoft软件的计算中
A：1.单孔微滴数量不够，2.单孔样本上样量不够，3.需要计算技术重复间的平均值和置信区间。如果实验中有perform技术重复，通常情况下建议merge各技术重复的微滴进行分析，可提高数据的精确度
A：双重ddPCR实验中，如果两重反应间互有干扰或竞争（表现形式一般为四团微滴无法处于矩形的线上），则使用索套法划分微滴会更精确。（如有实例，可现场讨论）
这两个定量结果其实并不矛盾。但对于ddPCR开发的mutation detection assays,到底该用拷贝数还是用突变率作为LOD仍然有待讨论。对于Liquid biopsy来说，可能两个检测结果同时分析才更有实际指导意义。个人倾向于用拷贝数浓度，而野生型的结果是必不可少的IPC。突变比例的测定可能会受样本制备的影响。
如果加入新的荧光标记或者阴性微滴的本底荧光信号出现负值时，需要校正补偿。
二、数字PCR介绍
数字PCR系统作为一种常用且有效的生命科学研究工具被广泛接受并开始进军临床市场。法国Stilla Technologies公司发布高通量数字PCR系统-Naica HT，配合新型的Opal芯片，较Naica数字PCR系统的通量有效提高四倍。
此外，该公司发布6色数字PCR检测系统的开发项目，增强系统的检测能力，并寻求与诊断领域和诊断试剂制造商的合作机会。
Stilla公司商业运作副总裁Caroline Charky在2019年2月的SLAS大会（Laboratory Automation and Screening Conference）会议上发布高通量数字PCR系统Naica HT和新型的Opal芯片，每天能检测≥240个样本，并在这次会议上获得了NPA新产品大奖。
Charky介绍道“Opal芯片采用了与第一代Naica系统相同的微流控技术，在芯片内部生成微滴。高通量Naica HT平台和Opal芯片与第一代Naica系统相比，提高了样本容量，并且在价格方面更有竞争力。”
Naica数字PCR系统由三部分组成：Geode装置包括自动化的微滴生成和PCR扩增步骤，在自组装的微滴阵列上进行PCR扩增大约需要1小时。Prime3微滴阅读分析系统，可以读取三色荧光，10分钟可以读取12个样本。Crystal Miner数据分析，能够自动识别三色荧光中每个阴阳性微滴，最终计算出目的DNA的绝对含量。
“Naica数字PCR系统使用的Sapphire芯片是第一代芯片，能够运行4个样本，每次可运行3张芯片，每天可以做≥60个样本。然而，在欧洲，亚洲，美国很多客户有高通量的需求，现在配合Naica HT高通量数字PCR系统，在与Sapphire同样大小的Opal芯片上可以同时进行16个样本，一次反应可以运行48个样本。”Charky说。
Stilla公司进行市场调研时，发现某些实验室特别是食品检测，肿瘤领域的应用中，如肿瘤病人的伴随诊断和用药监控以及需要数字PCR对阴性结果验证的大型qPCR实验室，都有高通量的需求。
Naica HT高通量数字PCR系统也能够进行三色多重反应，每次实验时间2.5小时，每天可以做五轮实验，Charky说道：“Naica HT高通量数字PCR系统每天可以做240个样本检测，也就是可以进行720个目的基因的检测。”
与Sapphire芯片相比Opal芯片反应体积更小。
“在Opal芯片中我们将反应体积从25μL降到了8μL。”Charky说。“你可以用更少的试剂”她说，对于要求更高灵敏度的实验，Opal芯片有一个集合两到三个密闭反应孔的策略，在95%的置信区间，灵敏度可达0.2copies/25μL。高通量Naica HT数字PCR系统兼容Sapphire芯片和Opal芯片。Naica数字PCR系统可以通过升级到高通量Naica HT数字PCR系统。
雅培实验室的快速诊断部门高级科学家Aric Joneja正在使用Stilla公司的Naica数字PCR系统进行产品研发。他们两年前购买了Naica数字PCR系统用于微滴PCR和微滴RT-PCR。他们计划开始使用Naica HT和Opal芯片。Joneja认为Naica系统人工操作少，耗材少并且操作简便。同时指出，Stilla具有数据回溯查看功能，很容易进行数据质控，查看数据原始结果。Joneja指出实验室肯定不会已经发现了三色检测系统还买两色检测系统。
在后续的访谈中Charky指出Stilla的专利完全不同于Bio-Rad。“每一个部分都是不同的，”她说，“是完全不同的技术。”
同时，Stilla公司正在开发六色检测的数字PCR系统，进行多重目标基因的数字PCR检测，“我们是全球第一家开发六色数字PCR系统的公司”Charky说。
正如之前的报道，2017年发表了用三色数字PCR检测EGFR突变，本月在O ncotarget杂志上发表了使用六色数字PCR检测非小细胞肺癌相关的突变，特别是EGFR基因的致敏和耐药突变的液态活检方法。
“六色数字PCR系统目前还在测试阶段，Stilla预计在2020或2021年发布，”Charky说,“我们公司作为仪器厂商，正在与用Naica开发和优化试剂的公司共同开发试剂，”Charky说,“一家使用Naica系统的德国研发公司，正在开发一种转基因生物的数字PCR检测方法，Stilla计划与这家公司合作推出完整的解决方案，另一家位于蒙彼利埃的公司正在开发用于CE-IVD的CTC、液体活检试剂盒。同时公司也自行开发临床项目，”Charky说,“已经有研发项目的产品能够最终获得CE-IVD。”
自从2016年发布Naica系统，公司已经历3年时间，Charky说,最近获得了illumina的融资。同时也是欧盟与皇家飞利浦主导的“改善癌症护理的液体活检和成像即LIMA”项目的合作方。
去年Stilla获得了巴黎39家医院联盟的公开招标，这39家医院将在接下来四年内完成Naica系统的采购。为了支持企业快速发展，公司正在扩大，在今年底将扩大三倍面积，Charky说。
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三、数字pcr用不起来的原因
1）模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。可以跑个电泳看看提取的DNA，PCR阳性样品与阴性样品是否有明显差别。如果确定是这种问题，可以增加模板量试试，但不一定行得通。
2）模板里面残留某种试剂成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是这种情况，可以用试剂盒把模板再纯化一下，或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。
数字pcr仪是分子诊断实验室的重要工具，直接影响临床检测结果的准确性、重复性、甚至工作效率。其主要用于科研及临床的基因扩增定性PCR基因扩增荧光/酶免终点定量DNA基因扩增基因芯片等其他基因分析应用的基因扩增适合国内外各种PCR试剂盒传染病类、科研类等。
退火温度过高。有可能，可以做个梯度PCR试一下。
dNTP浓度低时PCR产率及特异性均增高，适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L时就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）,所以,你不小心多加了4倍的量,会很影响PCR结果,即Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。
OK，小编就写到这里了，希望对大家有所帮助。